在细胞代谢网络中，磷酸化代谢物几乎无处不在。磷酸化糖参与糖酵解、糖异生和磷酸戊糖途径；核苷酸连接能量代谢与核酸合成；NAD类辅酶参与氧化还原调控；PLP是180多种脱羧酶的重要辅因子；而acyl-CoA则深度参与脂肪酸代谢和能量代谢。虽然它们连接着多个核心代谢通路，但也是代谢组学中一类典型的“难测分子”。一方面，磷酸化基团极强的亲水性使其在传统反相色谱中保留能力弱且分离困难，同时易与金属离子发生非特异性相互作用，引发峰形拖尾和吸附损失，严重限制其准确定量；另一方面，多类别磷酸化代谢的结构各异，致使离子化效率和质谱响应存在较大差异。此外，不同生物基质中磷酸化代谢物浓度范围跨度大，可达4-6个数量级，对检测灵敏度和定量准确性提出极高要求。而且商业化的稳定同位素内标有限，使传统依赖“一对一”同位素内标校正的精准定量策略难以全面覆盖。因此，“如何实现多类别磷酸化代谢物的同步、准确和可靠定量”一直是困扰磷酸化代谢组研究的关键技术难题。
复旦大学唐惠儒教授团队直面难题，于2022年构建了亲水性小分子代谢物的定量结构-色谱保留关系（QSRR）模型（Talanta. 2022, 238, 123059），并基于此建立了离子对反相色谱-质谱（IPRPLC-MS）分析方法，通过引入质谱友好的正己胺离子对试剂，改善了多类别磷酸化代谢物的色谱保留，但峰型拖尾及精准定量问题仍有待解决。研究团队进一步引入混合表面技术（HST），显著改善了色谱分离性能，实现了磷酸化糖、磷酸化氨基酸、核苷酸、NAD类辅酶及acyl-CoA等多类别磷酸化代谢物的良好色谱保留（容量因子＞2）和峰形对称性（拖尾因子＜2）（Anal. Chem.2025, 97 (3): 1681–1687.）。
然而，“能测 ≠ 能测准”，该研究团队最新的技术改进将“广谱检测”推进至精准定量，建立了14 min内同步定量125种磷酸化代谢物的方法，涵盖磷酸化糖、磷酸化氨基酸、核苷酸、核苷酸糖，以及源自水溶性维生素的酶辅因子如硫胺素（VB1）、核黄素（VB2）、烟酸（VB3）、泛酸（VB5） 吡哆醇（VB6）及其他有机磷化合物等10种类别。此外，团队还创新性地引入“基于相对响应因子的定量策略”，在缺乏一一对应稳定同位素内标的情况下实现准确定量，定量准确度满足80-120%，精密度和重复性满足CV＜20%，符合FDA要求。这一技术已成功应用于人体尿液、血浆、粪便、人源性细胞和兔肝脏组织等典型生物基质的磷酸化代谢组表型分析，以及揭示了厄洛替尼敏感型与耐药型人非小细胞肺癌细胞之间的磷酸化代谢组学差异。这为深入理解耐药机制提供了重要的定量分析工具及基础生物化学信息。（Anal. Chem. 2026, 98 (31): 22666–22673.）
因此，从“能测”到“测得全、测得准”，这连续性的技术推进为复杂生物体系中磷酸化代谢网络的全面解析提供了新的技术支撑。
