Advanced Science：复旦大学王瑞团队开发CRISPR-Scan方法， 实现急性髓系白血病相关同位点多变体高灵敏检测

  急性髓系白血病（AML）是一类具有高度异质性的血液系统恶性肿瘤，相关基因突变的准确检测对疾病分型、治疗决策及复发监测具有重要意义。其中，核仁磷酸蛋白1（NPM1）基因突变是AML的重要分子标志物，常表现为c.863_864位点的4-bp插入。目前已报道的此类插入变体超过100种，如何在区分突变型与野生型的同时，实现对多种插入序列的兼容识别，是核酸检测技术面临的挑战。

CRISPR/Cas系统具有可编程的核酸识别能力，为肿瘤相关基因突变检测提供了有力工具。然而，现有方法通常针对预先确定的突变序列设计识别元件，难以兼顾同一位点多种变体的检测需求。Cas13a具有一定的碱基错配耐受性，这一特性通常被视为影响序列分辨能力的因素，却也为多变体识别提供了新的可能。

  2026年10月14日，复旦大学人类表型组研究院王瑞团队联合复旦大学附属浦东医院等单位在国际期刊《Advanced Science》发表题为“CRISPR-Scan: Cas13a Mismatch Tolerance Enabled Ultra-Multiplexed Detection of Same-Site Indels in Acute Myeloid Leukemia”的研究论文。研究团队系统分析了LwaCas13a对碱基替换及插入、缺失的识别差异，并据此理性设计crRNA，建立了单管恒温检测平台CRISPR-Scan，为同一位点多种插入或缺失变体的高灵敏检测提供了新策略。

  CRISPR-Scan将RPA扩增、T7转录与LwaCas13a介导的荧光读出整合于同一反应体系。如图1所示，样本DNA经扩增后，在T7 RNA聚合酶作用下转录生成RNA。通过理性设计crRNA，使不同NPM1插入变体之间的序列差异位于LwaCas13a的错配耐受区域，单条crRNA即可兼容识别多种插入变体，激活LwaCas13a的旁切活性，切割RNA报告分子并产生荧光。野生型RNA相较于插入型缺少4个碱基，与crRNA配对窗口移位，难以有效激活LwaCas13a，从而实现突变型与野生型的区分。

图1 CRISPR-Scan系统的反应原理与工作流程

  为建立上述检测策略，研究团队系统分析了LwaCas13a对不同位置连续碱基替换及插入、缺失的响应。如图2所示，LwaCas13a在特定识别区域能够耐受连续碱基替换，却对插入或缺失较为敏感。利用这一差异，团队将不同插入变体之间的序列差异定位于错配耐受区域，使单条crRNA能够兼容识别多种插入序列，同时利用野生型和插入型基因与crRNA的配对窗口差异实现有效区分。以NPM1基因c.863_864位点的4-bp插入为模型，团队通过设计和筛选获得crRNA 9-12R，并通过不同错配模板及多种插入变体的检测实验，验证了其多变体识别能力。

图2 LwaCas13a对碱基替换与插入/缺失表现出不同的特异性且具有位置和碱基数量依赖性

  通过进一步优化反应条件，CRISPR-Scan可在39 ℃下反应30分钟，检出低至0.01%突变等位基因频率的NPM1插入突变。单管反应形式减少了扩增后开盖及产物转移操作，有助于简化检测流程并降低污染风险。在120例AML患者样本中，CRISPR-Scan共检出43例NPM1突变阳性样本，检测结果与二代测序（NGS）一致。对4例患者纵向样本的分析进一步显示，该平台的监测结果与NGS一致，并能够在部分一代测序（Sanger测序）未检出突变的样本中获得阳性信号，展示了其用于低丰度突变检测及可测量残留病（MRD）监测的潜力。此外，研究团队将这一策略拓展至KIT、BRAF和EGFR基因的相关缺失突变检测，并开发了配套微流控芯片与便携式装置（图3）。芯片集成突变检测、内部对照和空白对照反应腔，配合恒温加热与荧光观察组件，可直接观察检测结果并通过智能手机记录。50例临床样本的芯片可视化检测进一步展示了该平台向便携化应用拓展的可行性。

图3 自主开发的可用于POCT检测的便携装置和微流控芯片

该研究揭示了LwaCas13a在特定识别区域对连续碱基替换具有耐受性、对插入或缺失较为敏感的差异响应规律，并据此建立了兼顾多变体识别与野生型区分的crRNA设计策略。在此基础上，研究团队结合单管恒温反应和便携式读出，开发了CRISPR-Scan平台，实现了NPM1同位点多种插入变体的高灵敏检测，并通过临床样本分析及患者纵向监测展示了其应用潜力。该研究将Cas13a的错配耐受性转化为多变体检测优势，为突破单一识别元件的变体覆盖局限提供了新思路，也为肿瘤相关插入、缺失突变检测提供了新的技术路径。

复旦大学人类表型组研究院王瑞副研究员为本文通讯作者，复旦大学博士生白琳琳（现为复旦大学附属浦东医院助理研究员）为第一作者、东南大学医学院副研究员王贝和复旦大学附属浦东医院助理研究员史明敏为共同第一作者。感谢所有作者的贡献，感谢国家自然科学基金委项目资助。